哥谭市突然出现一群自称“动物园”的改造人：蜥蜴人（爬墙、再生）、蝙蝠人（回声定位、飞行）、章鱼人（多肢、伪装）。他们不犯罪，而是自行执法，手段残忍。蝙蝠侠追踪发现，他们的基因供体分别是：蜥蜴人来自“杀手鳄”，蝙蝠人来自“蝙蝠侠自己”的掉落血液样本，章鱼人来自“稻草人”的恐惧毒素变异体。幕后黑手是原韦恩集团生物部门主管，他想用“动物本能”取代人类的“道德理性”，创造一个没有犯罪但也没有自由的城市。蝙蝠侠拒绝了这个未来。最终决战在高谭水库，蝙蝠侠释放了一种专门降解动物基因的纳米病毒，让所有改造人变回人类。但蝙蝠侠自己也因此中毒，短暂失去了蝙蝠般的听觉和夜视能力。片尾彩蛋：小丑拿到了病毒样本，露出诡异笑容。
这部动画电影在常规的超级英雄对决中加入了生物伦理的讨论。动物园成员的设定充满想象力，尤其是“蝙蝠侠对蝙蝠人”的对决充满自我指涉的趣味。反派动机比很多真人电影更有说服力。
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